Menschenleben, Geld und Ruf retten mit einer schnellen, neuen Methode zur bakteriellen Lebensmittelprüfung
Genomgestütztes MALDI-TOF-Verfahren zur eindeutigen Identifizierung von Gefahren durch die Bacillus cereus-Gruppe
Valentin Pflüger, Mabritec AG
Im Januar 2026 kam es zu einem groß angelegten Rückruf von verunreinigter Säuglingsnahrung. Zuvor war das Endprodukt gemäß den geltenden Lebensmittelvorschriften geprüft und als unbedenklich eingestuft worden. Dennoch blieb ein Giftstoff unentdeckt, der zur Bakteriengruppe Bacillus cereus gehört. Dies lag an der unzureichenden Genauigkeit der herkömmlichen Testverfahren. Die gute Nachricht: Ein Unternehmen aus der Schweiz hatte bereits eine deutlich präzisere Methode entwickelt.
Zu Beginn dieses Jahres mussten mehrere Unternehmen potenziell gefährliche Säuglingsnahrung zurückrufen. Es bestand der Verdacht einer Verunreinigung mit dem Giftstoff Cereulid, dessen Vorkommen später bestätigt wurde. Der Rückruf verursachte hohe Kosten und fügte dem Qualitätsimage der betroffenen Unternehmen erheblichen Schaden zu. Doch wie konnte es dazu kommen? Offenbar wird im Rahmen des in der EU vorgeschriebenen Lebensmittelsicherheitskonzepts HACCP das Risiko einer Cereulid-Kontamination in fetthaltigen oder öligen Zutaten nicht ausreichend berücksichtigt.
Die Bakteriengruppe Bacillus cereus
Cereulid gehört zur Bakteriengruppe Bacillus cereus. Diese hat eine große gesellschaftliche Bedeutung, da sie mehrere eng verwandte Organismen in einem Bakterienkomplex vereint. Dazu zählen häufige Auslöser von Lebensmittelvergiftungen, ein bedeutender biologischer Gefahrenstoff sowie weltweit eingesetzte Mikroorganismen zur biologischen Schädlingsbekämpfung.
Aus Sicht der öffentlichen Gesundheit gehören B. cereus sensu stricto und seine nahen Verwandten zu den häufigsten Ursachen bakteriell bedingter Lebensmittelinfektionen. B. anthracis hingegen verursacht Milzbrand und steht seit jeher im Mittelpunkt von Biosicherheitsbedenken. B. thuringiensis-Stämme wiederum werden weltweit als „biologische“ Insektizide in der Landwirtschaft eingesetzt und tragen direkt zur Lebensmittelproduktion bei. Hinzu kommt, dass Vertreter der Bacillus cereus-Gruppe äußerst widerstandsfähige Sporen bilden. Dadurch sind sie nahezu überall verbreitet und lassen sich in einem Großteil aller Lebensmittel nachweisen.
Lebensmittelrelevante Risiken wichtiger Vertreter der Bakteriengruppe Bacillus cereus
Art
B. cereus s.s.
Typische Ökologie und Merkmale
Allgegenwärtig in Böden, Rohstoffen und Verarbeitungsumgebungen; mesophil; viele Stämme sind Träger milder Enterotoxine (Nhe, Hbl, CytK).
Wichtigste Risiken in Bezug auf Lebensmittel
Klassische durchfallartige Lebensmittelvergiftung; Sporen überleben beim Kochen und keimen während des Abkühlens oder bei unsachgemäßer Lagerung; Cereulid in stärkehaltigen Lebensmitteln kann Erbrechen und in seltenen Fällen schwere Komplikationen verursachen.
Art
B. thuringiensis
Typische Ökologie und Merkmale
Insektenpathogen; weit verbreitet als Biopestizid; genomisch sehr nah verwandt mit B. cereus; zwei Untergruppen; Stämme der Gruppe 1 weisen dieselben Enterotoxin-Gene (Nhe, Hbl, CytK2) und eine mittlere Zytotoxizität auf wie B. cereus s.s.
Wichtigste Risiken in Bezug auf Lebensmittel
Sporen aus Biopestiziden können Gemüse und Salate befallen; einige Stämme aus Lebensmitteln sind ähnlich zytotoxisch wie der Erreger B. cereus, sodass Rückstände gelegentlich Erkrankungen verursachen können, die denen von B. cereus ähneln.
Art
B. cytotoxicus
Typische Ökologie und Merkmale
Hitzetolerante Art, die bei Temperaturen von bis zu etwa 50–52 °C wachsen kann; produziert das hochzytotoxische Enterotoxin CytK-1; findet sich in Gemüsegerichten und getrockneten pflanzlichen Produkten.
Wichtigste Risiken in Bezug auf Lebensmittel
Verursacht schwere und manchmal tödliche Durchfallerkrankungen; hitzetolerante Sporen und Wachstum bei erhöhten Temperaturen stellen eine Herausforderung für die übliche Erhitzung von Fertiggerichten und Suppen dar.
Art
B. paranthracis
Typische Ökologie und Merkmale
Kürzlich beschriebene Art, die eng mit B. cereus und B. anthracis verwandt ist; diese Art umfasst alle derzeit charakterisierten chromosomal verwandten, Cereulid produzierenden (ces-positiven), Brechreiz erregenden Stämme.
Wichtigste Risiken in Bezug auf Lebensmittel
Cereulid-produzierende Stämme können innerhalb weniger Stunden nach dem Verzehr stark kontaminierter oder unsachgemäß gelagerter Lebensmittel plötzliches, heftiges Erbrechen auslösen. Bei sehr hoher Toxinkonzentration kann die mitochondriale Toxizität von Cereulid bei ansonsten gesunden Personen zu akutem Leberversagen, Nierenschäden und in seltenen Fällen zum Tod führen.
Art
B. anthracis
Typische Ökologie und Merkmale
Zoonotischer Erreger, der Milzbrand verursacht; tritt typischerweise bei infizierten Tieren und deren Erzeugnissen auf; Sporen sind in der Umwelt äußerst widerstandsfähig.
Wichtigste Risiken in Bezug auf Lebensmittel
Lebensmittelbedingter Milzbrand ist selten und steht meist im Zusammenhang mit stark kontaminiertem Fleisch oder traditionellen Erzeugnissen; das Risiko in modernen Lebensmittelketten wird als sehr gering eingeschätzt, erfordert jedoch bei Verdacht eine klare Unterscheidung von anderen Erregern dieser Gruppe.
Herkömmliche Testverfahren
In den meisten Routinelaboren gehört die Bakteriengruppe Bacillus cereus zum Alltag. Die gängigen Nachweismethoden beschränken sich jedoch meist auf eine ungenaue Identifizierung auf Gruppenebene. Dabei reicht das Spektrum der zugrunde liegenden Arten von klassischen Lebensmittelvergiftungserregern über Rückstände aus Biopestiziden bis hin zu seltenen Hochrisikostämmen. Zur Bewertung werden quantitative Kriterien (koloniebildende Einheiten, KBE) herangezogen. In Bezug auf die Bacillus cereus-Gruppe gelten in verzehrfertigen Lebensmitteln (RTE) typischerweise Werte von weniger als 10³ KBE/g als akzeptabel, Werte zwischen 10³ und 10⁴ KBE/g als grenzwertig und Werte ab 10⁴ bis 10⁵ KBE/g als ungünstig oder potenziell gefährlich. Diese Einordnung basiert auf Annahmen hinsichtlich der für die Toxinbildung erforderlichen Zelldichten.(1)
Leider greifen diese Grenzwerte wissenschaftlich zu kurz. Sie unterscheiden weder zwischen emetischen (ces-positiven) und nicht emetischen Stämmen noch berücksichtigen sie stammspezifische Enterotoxinprofile und matrix- bzw. temperaturabhängige Toxinproduktionskinetiken. Die tatsächliche Gefahr lässt sich daher allein anhand der KBE-Gesamtzahl nur unzureichend beurteilen.
Verbesserungen sind möglich, aber …
Die Gesamtgenomsequenzierung ist im Grunde die einzige Methode, mit der sich Isolate der Bakteriengruppe Bacillus cereus in einem Schritt eindeutig in klonale Verwandtschaftsbeziehungen auf der Ebene der Genomarten einordnen lassen. Gleichzeitig liefert sie präzise Informationen über Virulenz- und Resistenzgene. Keine Kombination aus phänotypischen Tests oder Einzel- bzw. Low-Plex-PCR-Verfahren reicht dafür aus. Dennoch hat sich diese Technologie im Routineeinsatz bislang nicht durchgesetzt. Der Grund liegt im hohen Aufwand. Es braucht erhebliche Investitionen, spezialisierte Bioinformatik, standardisierte Auswertungsprozesse sowie zusätzliche Zeit und Kosten pro Analyse.
Parallel dazu hat sich die MALDI-TOF-Massenspektrometrie (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) in der mikrobiologischen Routine etabliert und beschleunigt die Identifikation deutlich. Allerdings basiert sie auf Musterabgleichen mit klinisch orientierten Datenbanken, die die Vielfalt der Bacillus cereus-Gruppe nur teilweise abdecken.
Der Weg zur neuen Methode
Die Mabritec AG mit Sitz im Raum Basel ist auf die Identifikation von Mikroorganismen und die Analyse biologischer Systeme mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie spezialisiert. Das Unternehmen betreibt mit MabritecCentral (2) eine der weltweit größten Datenbanken für bakterielle Identifikation. Im Zuge des Aufbaus dieser Datenbank zeichnete sich vor einigen Jahren eine neue Möglichkeit ab.
Mithilfe des neuen MALDI-8020 und anderer Geräte gelang es Mabritec zu zeigen, dass sich die Bacillus cereus-Gruppe anhand der Massen ribosomaler Proteine differenzieren lässt. Grundlage dafür ist eine In-silico-Analyse in Kombination mit MALDI-TOF. Was lange als nicht umsetzbar galt, wurde damit Realität: die Bakterienidentifizierung mittels genomgestützter MALDI-TOF-MS auf Basis kommerziell verfügbarer Technologien.
Vertiefung des Konzepts der genomgestützten MALDI-TOF-MS
Wie funktioniert diese neue Methode im Detail? Ein Blick hinter die Kulissen zeigt, wie sich die Bakteriengruppe Bacillus cereus heute deutlich präziser identifizieren und bewerten lässt.
Die Datenbank MabritecCentral enthält in silico berechnete Massen, vor allem ribosomaler Proteine, aus mehr als 440.000 öffentlich verfügbaren Genomdatensätzen. Diese Daten wurden taxonomisch sorgfältig kuratiert und mit experimentellen MALDI-TOF-Spektren abgeglichen. Mabritec identifizierte 3.024 Genome der Gruppe Bacillus cereus, die alle derzeit bekannten 28 Arten abdecken. Für sämtliche Stämme wurden die Toxingene Nhe, Hbl, CytK, EntFM und ces sowie die Virulenzplasmide pXO1 und pXO2 extrahiert. Wie bereits in der Literatur beschrieben, konnte dabei eine starke Korrelation zwischen phylogenetischer Spezies und Toxingehalt bestätigt werden. Besonders deutlich zeigt sich dies beim emetischen Toxin Cereulid, das ausschließlich in Stämmen von B. paranthracis vorkommt. Interessanterweise tragen auch Isolate aus Cluster 2 von B. thuringiensis milde Toxine. Die für Milzbrand verantwortlichen Virulenzplasmide finden sich hingegen ausschließlich in einem Subcluster von B. anthracis. CytK1, die hochzytotoxische Variante des Cytotoxin K, wurde nur in B. cytotoxicus nachgewiesen.
Die In-silico-Analyse von 32 ribosomalen Untereinheitsproteinen im Massenbereich von 4 bis 30 kDa zeigte, dass sich alle Spezies in klar unterscheidbaren Clustern gruppieren, die potenziell mittels MALDI-TOF-MS differenziert werden können. Anhand der Vorhersagen wurden besonders aussagekräftige ribosomale Proteine im Bereich von 15 bis 25 kDa identifiziert, die mit Standard-Ausstrichpräparat und CHCA-Matrix kaum nachweisbar sind. Durch den Einsatz von Sinapinsäure als Matrix in Kombination mit einer angepassten Messmethode, einschließlich optimierter Laserleistung, Detektorspannung und Peak-Erkennung, lassen sich ribosomale Proteine im Bereich von 4 bis 28 kDa zuverlässig detektieren (Abbildung 1).
Eine weitere Herausforderung bei der Entwicklung der Methode bestand darin, die Sporenbildung zu kontrollieren, um eine hohe Spektrenqualität sicherzustellen. Sporen wirken sich bekanntermaßen negativ auf die Spektren aus, da kleine säurelösliche Proteine aus dem Sporenkern das Spektrum dominieren und insbesondere im höheren Massenbereich die ribosomalen Markerpeaks überlagern können. Diese Einschränkung konnte durch zwei gezielte Maßnahmen überwunden werden. Zum einen wurde eine kurze Inkubationszeit von 4 bis 6 Stunden gewählt, um überwiegend vegetative Zellen zu erzeugen und die Sporenbildung zu minimieren. Zum anderen wurde ein Probenvorbereitungsprotokoll ohne Säureextraktion etabliert, das eine mechanische Zellaufschlussmethode mit 0,1 mm großen Glasperlen umfasst, um den Einfluss von Sporen weiter zu reduzieren. Diese Anpassungen ermöglichen die Erzeugung hochwertiger Spektren für Stämme der Bacillus cereus-Gruppe.
Das neue Modul für die Bacillus cereus-Gruppe wurde mit 124 genomsequenzierten Referenzstämmen validiert, die alle aktuell bekannten Spezies abdecken. Sämtliche Analysen wurden auf einem AXIMA Confidence sowie einem 8030 EasyCare MALDI-TOF-MS durchgeführt. Dabei wurden eine Sensitivität von 98,4 % und eine Spezifität von 99,9 % erreicht. In einer ergänzenden Studie mit 16 klinischen Isolaten konnten zudem alle Stämme korrekt identifiziert werden. Neben der Artenidentifizierung wurden für fünf als B. anthracis identifizierte Stämme die Isolate einer ribosomalen Unterlinie von B. anthracis zugeordnet, die die Virulenzplasmide pXO1 und pXO2 nicht beherbergen. Diese Vorhersage konnte durch Ganzgenomsequenzierung bestätigt werden.(3)
Über die Identifizierung auf Speziesebene hinaus wurde untersucht, ob sich Toxine der Bakteriengruppe Bacillus cereus direkt mittels MALDI-TOF-MS nachweisen lassen. Dabei gelang der direkte Nachweis des emetischen Toxins Cereulid mittels MALDI-TOF-MS sowohl aus Kulturen als auch aus Lebensmitteln.(4) Es zeigte sich, dass sich Cereulid-produzierende B. paranthracis-Stämme durch einfaches Auftragen einer kleinen Menge Kulturmaterial auf ein MALDI-Target und Messung im LDI-Modus ohne Matrix im Massenbereich von 700 bis 1.500 Da analysieren lassen. Das Cereulid wird dabei bei m/z 1.191[M + K]+ detektiert (Abbildung 2). Dieser schnelle und unkomplizierte Ansatz stellt eine effiziente und zuverlässige Methode dar, um die Cereulidproduktion in verdächtigen Stämmen der Bacillus cereus-Gruppe zu bestätigen.
Zusätzlich wurde die Möglichkeit untersucht, Cereulid direkt in Lebensmittelproben nachzuweisen. Für den Test wird 1 g homogenisierte Probe (z. B. Reis, Milchreis, Ravioli oder Kartoffelpüree) mit 1 ml 75-prozentigem (v/v) Ethanol in einem 2-ml-Gefäß gemischt, 1 Minute vortexiert und anschließend bei 6.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird 1 μl des klaren Überstands in doppelter Ausführung auf ein Edelstahl-Target aufgetragen, bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend mit 1 μl CHCA-Matrix überschichtet. Cereulid ist stark hydrophob und bindet intensiv an Lebensmittelbestandteile, weshalb die Extraktionseffizienz stark von der Art des analysierten Lebensmittels abhängt. Aus stärkehaltigen Lebensmitteln wie Reis lässt es sich in der Regel besser zurückgewinnen als aus fettreichen, proteinreichen oder komplex zusammengesetzten Speisen, in denen es sich bevorzugt in Lipidphasen verteilt oder an Proteine bindet. Die Nachweisgrenzen variieren je nach Matrix zwischen 30 ng/ml und 30 pg. Für jede Probe wird eine Verdünnungsreihe mit definierten Cereulid-Zusätzen durchgeführt, um die Nachweisgrenze festzulegen. In der Praxis kann für die Risikobewertung davon ausgegangen werden, dass Cereulidmengen, die typische emetische Lebensmittelvergiftungen verursachen, die in Ausbrüchen im niedrigen Mikrogramm-pro-Gramm-Bereich liegen, mit diesem LDI-Workflow in geeigneten Matrizes zuverlässig nachweisbar sind.
Wissenschaft zum Nutzen von Verbrauchern, Laboren und Unternehmen
Die Kombination genombasierter Referenzen zur Identifizierung toxinbildender Stämme mit einer schnellen und kosteneffizienten MALDI-TOF-MS-Analyse führt im Gegensatz zur aufwendigen und kostenintensiven Genomsequenzierung zu neuen Möglichkeiten in der Routineanalytik. Erstmals lassen sich alle Spezies der Bakteriengruppe Bacillus cereus im Routinebetrieb differenzieren und gleichzeitig hinsichtlich ihres potenziellen Virulenzprofils bewerten. Damit wird es möglich, sämtliche Spezies mittels MALDI-TOF-MS zu identifizieren und ihnen auf Basis einer genomgestützten Datenbank ein spezifisches Toxinprofil zuzuordnen. Abhängig vom Analyseergebnis sowie von Matrix und Produkt können potenziell kritische Lebensmittel frühzeitig erkannt und gezielt aus dem Verkehr gezogen werden.
Die Methode ist entlang der gesamten Produktionskette einsetzbar, von der Rohware über die Verarbeitung bis hin zum Endprodukt, und eignet sich für die Lebensmittel-, Pharma- und Kosmetikindustrie. Sie unterstützt Qualitätsverantwortliche dabei, die häufig nachgewiesene Bacillus cereus-Gruppe besser zu bewerten, die Lebensmittelsicherheit zu erhöhen und Verbraucher wirksamer zu schützen. Im Mabritec-Labor wird das Verfahren bereits routinemäßig eingesetzt. Dort wurden bisher mehr als 1.600 Isolate der Bacillus cereus-Gruppe aus Lebensmitteln und industriellen Proben erfolgreich identifiziert.
Bessere Arbeit dank guter Hilfsmittel
Die genomgeführte MALDI-TOF-MS ermöglicht eine zuverlässige Auflösung auf Speziesebene innerhalb der Bacillus cereus-Gruppe und verknüpft Isolate mit charakteristischen Toxin- und Virulenzprofilen, die mit herkömmlichen KBE-basierten und routinemäßigen Identifikationsmethoden verborgen bleiben. Die Arbeiten der Wissenschaftler bei Mabritec zeigen, dass der schnelle MALDI- beziehungsweise LDI-basierte Nachweis von Cereulid aus Kulturen und geeigneten Lebensmittelmatrizes technisch umsetzbar, ausreichend sensitiv und problemlos in bestehende Routinelabore integrierbar ist. Dadurch werden die Risikobewertung und Überwachung emetischer Stämme der Bacillus cereus-Gruppe deutlich gestärkt. Durch den Einsatz von Shimadzu Geräten ist es so einem innovativen Schweizer Unternehmen gelungen, einen neuen Ansatz zu entwickeln, der die Gesundheit von Verbrauchern besser schützt und Unternehmen gleichzeitig vor kostspieligen und imageschädigenden Produktrückrufen bewahrt.
Quellen:
[1] Carroll LM, Wiedmann M, Kovac J. Proposal of a Taxonomic Nomenclature for the Bacillus cereus Group Which Reconciles Genomic Definitions of Bacterial Species with Clinical and Industrial Phenotypes. mBio. 2020 Feb 25;11(1):e00034-20. doi: 10.1128/mBio.00034-20. PMID: 32098810; PMCID: PMC7042689.
[2] Institute of Medicine and National Research Council. 2003. Scientific Criteria to Ensure Safe Food. Washington, DC: The National Academies Press.
[4] Muigg V, Cuénod A, Purushothaman S, Siegemund M, Wittwer M, Pflüger V, Schmidt KM, Weisser M, Ritz N, Widmer A, Goldenberger D, Hinic V, Roloff T, Søgaard KK, Egli A, Seth-Smith HMB. Diagnostic challenges within the Bacillus cereus-group: finding the beast without teeth. New Microbes New Infect. 2022 Oct 26;49-50:101040. doi: 10.1016/j.nmni.2022.101040. PMID: 36385748; PMCID: PMC9641004.
[5] Ducrest PJ, Pfammatter S, Stephan D, Vogel G, Thibault P, Schnyder B. Rapid detection of Bacillus ionophore cereulide in food products. Sci Rep. 2019 Apr 9;9(1):5814. doi: 10.1038/s41598-019-42167-0. PMID: 30967595; PMCID: PMC6456620.
