Erkennung und Behebung von Schwankungen der Retentionszeit
Dr. Anna Cooper, Shimadzu UK
Fehlersuche in der Praxis: Tipps für stabile HPLC-Retentionszeiten und zuverlässige Ergebnisse
Wenn sich Retentionszeiten in der HPLC verschieben oder schwanken, können selbst selektive Detektoren keine sichere Identifizierung mehr gewährleisten. Daher ist es für zuverlässige HPLC-Methoden unerlässlich, die Retentionszeit zu kontrollieren und zu verstehen. Dieser Artikel ist der zweite Teil einer Serie zur Fehlersuche für Anwender von Laborinstrumenten. Er zeigt die wichtigsten Ursachen für schwankende Retentionszeiten auf und bietet praktische Möglichkeiten zu deren Diagnose und Behebung.
Fehlersuche bei schwankenden HPLC-Retentionszeiten
Die Retentionszeit ist einer der wichtigsten Parameter in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Sie hilft dabei, Analyten zu identifizieren, die Systemtauglichkeit zu prüfen und die Zuverlässigkeit einer Methode zu bewerten. In modernen HPLC-Systemen kommen in der Regel UV-Vis-, Fluoreszenz- oder Brechungsindexdetektoren zum Einsatz. Optische Detektoren wie UV-Vis- und Fluoreszenzdetektoren sind zwar oft sehr selektiv gegenüber Verbindungen mit Chromophoren oder Fluorophoren, basieren jedoch alle auf der grundlegenden Annahme, dass das chromatographische System reproduzierbare Retentionszeiten liefert.
Abbildung 1: Beispiel eines Chromatogramms mit Retentionszeitverschiebung
Wenn sich Retentionszeiten verschieben oder schwanken, können selbst selektive Detektoren keine sichere Identifizierung mehr gewährleisten. Peaks liegen dann möglicherweise außerhalb des vordefinierten Zeitfensters oder eluieren sogar in einer anderen Reihenfolge. Das kann zu mehrdeutigen oder falschen Ergebnissen führen. Daher ist es für zuverlässige HPLC-Methoden unerlässlich, die Retentionszeit zu kontrollieren und zu verstehen.
Doch welche Ursachen führen zu solchen Schwankungen der Retentionszeit? Und wie lassen sich diese erkennen, beheben oder sogar vermeiden?
1. Temperatur – ein oft unterschätzter Faktor
Die Temperatur beeinflusst die Retention sowohl bei der Umkehrphasen- als auch bei der Normalphasen-HPLC direkt. Mit steigender Temperatur:
- sinkt die Viskosität der mobilen Phase;
- fällt der Gegendruck der Säule;
- verändert sich die Wechselwirkung zwischen Analyt und stationärer Phase.
Als Faustregel gilt: Eine Temperaturänderung von 1 °C kann die Retentionszeit um etwa 1–2 % verschieben. Spät eluierende Analyten reagieren meist stärker auf Temperaturänderungen als früh eluierende. In der Praxis bedeutet das: Schon eine scheinbar kleine Schwankung von 3–5 °C kann die gesamte Laufzeit und sogar die Elutionsreihenfolge merklich verändern.
Bei größeren Analyten kann die Temperatur außerdem strukturelle Veränderungen hervorrufen, etwa eine teilweise Entfaltung oder Umordnung der Sekundär-/Tertiärstruktur. Dadurch werden Wechselwirkungsstellen freigelegt oder verdeckt, was sich auf die Retention, Selektivität und Peakform auswirkt.
Kürzere Laufzeiten sind nicht immer vorteilhaft
Chromatogramme von Parabengemischen, gemessen bei 20 °C und 50 °C, zeigen in der Regel, dass sich die Gesamtanalysezeit bei 50 °C fast halbiert. Das kann hilfreich sein, wenn eine Methode beschleunigt werden soll. Voraussetzung ist jedoch, dass die maximal zulässige Säulentemperatur eingehalten wird. Gleichzeitig kann eine höhere Temperatur die Lebensdauer der Säule verkürzen. Besonders bei sauren oder neutralen pH-Bedingungen entsteht eine stärkere Belastung für das Siliziumdioxidgerüst.
Außerdem reagieren nicht alle Analyten gleich auf Temperaturänderungen. Sorbinsäure und Benzoesäure können zum Beispiel bei 20 °C noch klar getrennt sein, bei 30 °C jedoch gemeinsam eluieren. Bei noch höheren Temperaturen kann sich sogar ihre Elutionsreihenfolge umkehren. Werden solche Effekte nicht beachtet, kann es zu falschen Identifizierungen oder fehlerhaften Ergebnissen kommen.
2. Flussrate – Diagnose von pumpenbedingten Retentionsabweichungen
Der zweite entscheidende Faktor für die Retentionszeit ist die Flussrate. Sowohl bei Gradienten als auch bei isokratischen Methoden hängen Retentionsfaktor und Gradientenprofil direkt von der Flussrate ab. Schon kleine Abweichungen vom eingestellten Wert wirken sich unmittelbar auf die Retentionszeit aus.
Verschleiß der Pumpe
HPLC-Pumpen enthalten Verschleißteile, zum Beispiel:
- Kolbendichtungen
- Rückschlagventile
- Pumpenköpfe und Kolben
Mit der Zeit nutzen sich diese Komponenten ab, können undicht werden oder nicht mehr richtig abdichten. Dadurch sinkt die tatsächliche Flussrate oder wird instabil. Die Folge sind unregelmäßige oder abweichende Retentionszeiten, oft begleitet von Druckschwankungen.
Einfache Pumpenprüfung
Die Leistung der Pumpe lässt sich am einfachsten durch eine Kalibrierung überprüfen. Verwenden Sie einen Messzylinder, verbinden Sie eine Rückdruckkapillare direkt mit der Pumpe und stellen Sie eine definierte Flussrate ein. Lassen Sie dann ein bestimmtes Volumen in einen Messzylinder laufen und messen Sie die benötigte Zeit. Vergleichen Sie anschließend das gemessene Ergebnis mit der erwarteten Flussrate.
Weichen die Werte deutlich ab, sollten Dichtungen, Rückschlagventile oder andere Pumpenteile überprüft und gegebenenfalls gewartet oder ausgetauscht werden. Eine regelmäßige Kontrolle der Verschleißteile des HPLC-Systems ist generell empfehlenswert. Ersatzteile sollten stets verfügbar sein, damit defekte Komponenten schnell ausgetauscht werden können.
Praktische Tipps:
- Kalibrieren Sie die Pumpe regelmäßig und dokumentieren Sie die Ergebnisse.
- Tauschen Sie Kolbendichtungen, Rückschlagventile und andere Verschleißteile in festgelegten Intervallen oder bei Verdacht auf Probleme aus.
- Beobachten Sie Systemdruck und Flussanzeige. Eine instabile Basislinie oder schwankender Druck sind oft erste Warnzeichen.
3. Eluenteneffekte – die mobile Phase als Ursache für Schwankungen
In vielen Laboren lassen sich Schwankungen der Retentionszeit auf die mobile Phase zurückführen. Schon geringfügige Änderungen hinsichtlich Zusammensetzung, Dichte oder Herstellungsverfahren können die Elutionsstärke erheblich verändern.
3.1. Unzureichende Reequilibrierungszeit bei Gradientenläufen
Bei Umkehrphasenmethoden werden häufig Gradienten und ein intensiver organischer Waschschritt eingesetzt, um stark gebundene Analyten herauszulösen. Nach einem solchen Schritt muss die Säule vor der nächsten Injektion vollständig auf die Ausgangsbedingungen zurückgesetzt werden.
Ist die Zeit für die Equilibrierung zu kurz:
- enthält die Säule noch einen erheblichen Anteil des starken Lösungsmittels;
- ist die effektive Ausgangszusammensetzung organischer als beabsichtigt;
- verkürzen sich die Retentionszeiten von Lauf zu Lauf oder schwanken.
Als allgemeine Empfehlung gilt: Bei der Umkehrphasenchromatographie sollten mindestens zehn Säulenvolumina für die Equilibrierung vorgesehen werden. Bei Normalphasen-, hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC-) oder Ionenpaar-Methoden sind es deutlich mehr.
Wenn die Zeit für die Equilibrierung zu kurz ist, kann dies zu Schwankungen der Retentionszeit oder, wie im obigen Beispiel gezeigt, zu zunehmend kürzeren Retentionszeiten von Messung zu Messung führen, da sich noch starkes Lösungsmittel auf der Säule befindet. In diesem Fall ist die Säule nicht mehr im Gleichgewicht.
3.2. Lagerungsbedingte Veränderungen der Eluentenzusammensetzung
Mobile Phasen müssen vor Verdunstung und Verunreinigungen geschützt werden. Wenn Flaschen offen oder unzureichend verschlossen bleiben:
- kann sich der Gehalt an organischen Lösungsmitteln verändern (z. B. Verdunstung von Acetonitril aus einem Wasser-Acetonitril-Gemisch);
- nimmt die Elutionsstärke mit der Zeit ab, was zu zunehmend längeren Retentionszeiten führt;
- kann die Aufnahme von Sauerstoff oder CO₂ den pH-Wert verändern, insbesondere in ungepufferten wässrigen Phasen;
- kann es zu Bakterienwachstum in wässrigen mobilen Phasen kommen, was die Leistung des Geräts beeinträchtigen kann.
Praktische Tipps:
- Verwenden Sie ordnungsgemäß verschlossene, chemisch kompatible Flaschen.
- Beschriften Sie die Elutionsmittel mit dem Herstellungsdatum, der Zusammensetzung und den Initialen des Anwenders.
- Setzen Sie die Elutionsmittel keiner direkten Sonneneinstrahlung oder kalter Luft aus Klimaanlagen aus.
- Verwenden Sie Kohlefilter auf den Lösungsmittelbehältern, um die Verdunstung von Lösungsmitteln zu begrenzen und Gesundheits- und Sicherheitsrisiken im Labor zu verringern.
3.3. Abweichungen in der Eluentenzubereitung
Selbst bei Verwendung der richtigen Lösungsmittel können Fehler bei der Vorbereitung zu Unterschieden in der Elutionsstärke führen. Ein klassisches Beispiel ist die Vorbereitung einer mobilen Phase aus 50 % Methanol in Wasser:
Methode 1:
- Wasser/Methanol = 1/1 (v/v)
- 500 ml Wasser und 500 ml Methanol werden separat abgemessen und anschließend vermischt.
- Das Gesamtvolumen beträgt nicht 1 l, sondern 0,94 l.
Methode 2:
- 50 % (v/v) Methanol-Wasser-Lösung
- 500 ml Methanol werden in einen 1-l-Messkolben gegeben, der anschließend mit Wasser auf 1 l aufgefüllt wird.
- Das Gesamtvolumen beträgt 1 l, wobei der Wasseranteil im Vergleich zum vorherigen Beispiel höher ist.
In beiden Fällen kann von einer Lösung mit „50 % MeOH“ die Rede sein, doch in der Praxis weisen diese beiden Lösungen unterschiedliche Elutionsstärken auf, wie das folgende Beispiel mit einem Phosphatpuffer und Acetonitril zeigt. Die Retentionszeiten der einzelnen Analyten schwanken erheblich und können im schlimmsten Fall außerhalb des Identifizierungszeitfensters liegen.
Praktische Tipps zur Vermeidung dieses Problems:
- Geben Sie immer an, ob es sich um Konzentrationen in % (v/v), % (w/w) oder % (w/v) handelt.
- Verwenden Sie Messgefäße aus Glas und schriftliche Standardarbeitsanweisungen für die Eluentenzubereitung.
- Bereiten Sie mobile Phasen nach Möglichkeit aus konzentrierten Stammlösungen oder direkt mit dem Dosiersystem des jeweiligen Geräts vor.
- Verwenden Sie bei kritischen Anwendungen handelsübliche vorgemischte mobile Phasen, um bedienerbedingte Abweichungen zu vermeiden.
4. Weitere Ursachen für Schwankungen der Retentionszeit
Neben Temperatur, Durchfluss und Elutionsmitteln können mehrere weitere Faktoren zu Schwankungen der Retentionszeit führen:
- Unzureichende Pufferkapazität oder falscher Puffer-pH-Wert
- Mangelhafte Online-Mischung in Systemen mit niedrigem Druckgradienten
- Eine teilweise ausgetrocknete oder kontaminierte Säule, insbesondere nach Lagerung in reinem organischem Lösungsmittel oder 100 % wässriger Phase in Umkehrphasensystemen
- Alterung oder Beschädigung der Säule (Verlust der gebundenen Phase, Hohlräume)
Praktische Checkliste zur Einhaltung der Retentionszeiten:
- Überprüfen Sie die Temperaturregelung.
- Überprüfen Sie die Pumpe und die Flussratenkalibrierung.
- Bereiten Sie frische Elutionsmittel nach einem validierten Verfahren vor und vergleichen Sie die Retentionszeiten für Referenzstandards.
- Bei anhaltenden Problemen testen Sie mit einer neuen Säule, um zwischen säulenbezogenen und systembezogenen Ursachen zu unterscheiden.
5. Praktische Checkliste zur Einhaltung der Retentionszeiten
Allgemeines
- Führen Sie Systemeignungstests mit Referenzlösungen durch und dokumentieren Sie die Retentionszeiten und die Auflösung.
- Führen Sie ein Säulenprotokoll (Anzahl der Injektionen, verwendete mobile Phase, Lagerbedingungen) und ein Wartungsprotokoll für das Gerät.
Temperatur
- Verwenden Sie unbedingt einen Säulenofen, wenn die Stabilität der Retentionszeit wichtig ist.
- Vermeiden Sie große Temperaturschwankungen im Labor und Luftzug im Bereich des Säulenofens.
Durchfluss/Pumpe
- Führen Sie regelmäßig Pumpenleistungsprüfungen durch und ersetzen Sie Verschleißteile planmäßig.
- Überwachen Sie den Systemdruck auf ungewöhnliche Schwankungen oder allmähliche Veränderungen.
Elutionsmittel
- Erarbeiten und befolgen Sie Standardarbeitsanweisungen für die Eluentenzubereitung.
- Lagern Sie Elutionsmittel in verschlossenen Behältern mit ordnungsgemäßer Kennzeichnung und fern von Hitze oder direkter Sonneneinstrahlung.
- Lassen Sie nach Gradientenläufen oder Lösungsmittelwechseln ausreichend Zeit zur Reequilibrierung, insbesondere bei:
- Normalphasenmethoden
- Umkehrphasenmethoden mit Ionenpaar-Reagenzien
- Methoden mit 100 % wässrigen mobilen Phasen
Zu beachtende problematische Bedingungen
- Umkehrphasenläufe mit 100 % wässrigem Elutionsmittel
- Stark saure oder mäßig bis stark alkalische Elutionsmittel (typischerweise pH > 7) auf Säulen auf Siliziumdioxidbasis
- Lange Leerlaufzeiten ohne Durchfluss, insbesondere bei gepufferten oder salzhaltigen mobilen Phasen
Schlussbemerkungen
Schwankende Retentionszeiten sind nicht nur ärgerlich, sondern beeinträchtigen auch direkt die Zuverlässigkeit qualitativer und quantitativer Ergebnisse. Oft reichen schon kleine und leicht zu übersehende Faktoren – etwa ein geringfügig zu warmes Labor, eine verschlissene Pumpendichtung oder eine nicht richtig verschlossene Eluentenflasche – aus, um die Retention zu destabilisieren und die Ergebnisse zu verfälschen.
Durch eine systematische Betrachtung von Temperatur, Durchflussrate, Eluentenzubereitung und Säulenbeschaffenheit lassen sich die meisten Probleme im Zusammenhang mit der Retentionszeit schnell diagnostizieren und lösen. Eine sorgfältige Dokumentation, zuverlässige Methoden und einige einfache tägliche Kontrollmaßnahmen tragen wesentlich dazu bei, dass die Retentionszeiten stabil bleiben und die Genauigkeit Ihrer HPLC-Daten gewährleistet ist.
