Think big – Reinheit im großen Maßstab
Präparative HPLC als Schlüssel zur Isolierung von Wirkstoffen
Dr. Martin Meyer, Shimadzu Europa GmbH
Medikamente retten Leben, lindern Leid und prägen die moderne Medizin wie kaum eine andere Errungenschaft. Doch bevor ein Wirkstoff zu einer Heilung beitragen kann, muss er entwickelt, getestet und in höchster Reinheit gewonnen werden. Denn die Wirksamkeit hängt nicht nur von der richtigen Dosierung und Anwendung ab, sondern auch von der Reinheit der Inhaltsstoffe. Hier kommt die präparative HPLC ins Spiel – eine Schlüsseltechnologie, die entscheidend für die Qualität und Wirksamkeit neuer Medikamente ist. Dieser Beitrag untersucht, ob die Technik in der Lage ist, die strengen Anforderungen zu erfüllen.
In der Arzneimittelentwicklung arbeiten Forscher unermüdlich daran, neue Medikamente zu entwickeln, die es ermöglichen, Infektionen zu bekämpfen, chronische Erkrankungen zu kontrollieren und die Lebensqualität von Millionen von Menschen zu verbessern. Unter ihnen sind leidenschaftliche Chemiker, die an vielversprechenden neuen Wirkstoffen forschen, die womöglich sogar eine Behandlung einer seltenen, aber verheerenden Krankheit ermöglichen könnten.
Einen Wirkstoff zu isolieren, ist mit Herausforderungen verbunden. Die Chemiker müssen sich einem häufig komplexen und anspruchsvollen Prozess stellen, bei dem jederzeit die Gefahr besteht, dass Rückstände der Ausgangsverbindung im Endprodukt verbleiben oder unerwünschte Nebenprodukte entstehen.
Diese Verunreinigungen könnten nicht nur die Wirksamkeit des Medikaments beeinträchtigen, sondern auch toxische Reaktionen hervorrufen oder unerwartete Nebenwirkungen auslösen. Eine große Verantwortung, denn der Grat zwischen Heilmittel und Gift ist schmal.
Daher benötigen die Chemiker ein Verfahren, das in der Lage ist, den Hauptstoff effizient zu isolieren und gleichzeitig die unerwünschten Verbindungen abzutrennen. Hier stehen ihnen verschiedene Methoden wie Kristallisation, Filtration und Destillation zur Verfügung.
Aber gerade im Entwicklungsprozess wäre jedoch eine Technik von Vorteil, die nicht nur die vorhandenen Stoffe trennt, sondern auch deren Identität bestimmt. Diese Möglichkeit bietet die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Sie eröffnet den Chemikern neue Wege, ihre Zielverbindungen präzise zu isolieren und zu analysieren.
Die HPLC ist eine analytische Technik, die in der chemischen und pharmazeutischen Industrie weitverbreitet ist. Sie ermöglicht die Trennung und Analyse komplexer Gemische, was für die Qualitätskontrolle und Forschung unerlässlich ist.
Von der analytischen zur präparativen HPLC
Die HPLC ist meist darauf optimiert, sehr kleine Konzentrationen von Stoffen noch detektieren zu können. Für die Isolierung umfangreicherer Mengen eines Wirkstoffs ist es jedoch notwendig, deutlich größere Dimensionen zu wählen. Dazu müssen sowohl die Gerätekomponenten als auch die Methode selbst skalierbar sein.
Eine maßgebliche Komponente, die darüber entscheidet, wie viel eines Stoffes auf ein chromatographisches System aufgebracht werden kann, ist die Trennsäule. In der Regel haben die Trennsäulen für analytische Anwendungen ein inneres Volumen von 0,1 bis 3 ml und können etwa 3–20 mg Substanz auftrennen. Im Gegensatz dazu verfügen präparative Säulen über ein inneres Volumen von 20 bis 300 ml und erreichen Auftrennungskapazitäten von 300 bis 2.000 mg.
Durch das größere Volumen der präparativen Säulen müssen auch die Flussraten des Laufmittels angepasst werden, was zu einem Lösemittelverbrauch führt, der 20- bis 100-mal höher sein kann als bei analytischen Anwendungen.
Daher ist es wichtig, präparative HPLC idealerweise in Kombination mit bereits etablierten Methoden durchzuführen, um den Lösemittelverbrauch zu minimieren.
Wie die meisten erfahrenen Analytiker wissen, ist die Methodenentwicklung einer der zeitintensivsten Aspekte in der Analytik. Daher empfiehlt es sich, die Methode zur Abtrennung des Wirkstoffs von Nebenprodukten zunächst im analytischen Maßstab zu entwickeln und anschließend auf den präparativen Maßstab zu skalieren. Dieser Skalierungsprozess ist relativ unkompliziert und kann mithilfe der Software von Shimadzu vollständig automatisiert werden (Abbildung 1).
Damit eine Hochskalierung erfolgreich funktioniert, ist es entscheidend, dass sowohl die analytische als auch die präparative Säule in ihren Trenneigenschaften sehr ähnlich sind. Daher ist es ratsam, dieselbe Säulenserie zu verwenden. Shimadzu bietet mit der Shim-pack G und der Shim-pack Scepter Serie zwei Säulenreihen an, die von kleinen analytischen Dimensionen bis hin zu großen präparativen Säulen vollständig verfügbar sind (Abbildung 2).
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Von Salicylsäure zu Aspirin®
Wie die Hochskalierung und Isolierung durch präparative HPLC funktioniert, lässt sich gut am Beispiel eines der bekanntesten Wirkstoffe weltweit zeigen: Acetylsalicylsäure (ASS) – Aspirin®.
ASS ist ein schmerzstillender, entzündungshemmender, fiebersenkender und thrombozytenaggregationshemmender (TAH) Arzneistoff aus der Gruppe der nicht steroidalen Antirheumatika (NSAR) und wird seit Anfang des 20. Jahrhunderts in verschiedenen Produkten von Pharmaherstellern vertrieben. Der Wirkstoff ist zudem auf der Liste der unentbehrlichen Arzneimittel der WHO aufgeführt.
Der Ausgangsstoff für ASS ist Salicylsäure, die in einer Vielzahl von Pflanzen vorkommt. Allerdings ist Salicylsäure nicht so gut verträglich, weniger wirksam und wird vom Körper schlechter aufgenommen als Aspirin® (Acetylsalicylsäure). Die Synthese von Aspirin® erfolgt durch die Acetylierung von Salicylsäure mit Essigsäureanhydrid.
Jedoch können bei der Synthese Rückstände von Salicylsäure im Endprodukt verbleiben. Diese unerwünschten Rückstände lassen sich effektiv mit präparativer HPLC abtrennen, wodurch die Reinheit des Endprodukts sichergestellt wird (Abbildung 3).
Zunächst wurde eine Methode entwickelt, um durch den Einsatz von Standards die Retentionszeiten für Aspirin® und Salicylsäure zu etablieren (Analyseparameter sind in Tabelle 1 zu finden). Anschließend wurde eine Probe des synthetisierten Aspirin®s untersucht. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von Salicylsäure neben dem Hauptprodukt (Abbildung 4).
| Analytische Methode | |
| System | Nexera Prep/LH-40 |
| Säule | Shim-Pack GIST 5 µm 250 x 4.6 mm |
| Mobile Phase | Wasser 50%/Acetonitril 50 %/ 0.5 % Phosphorsäure |
| Programm | Isokratisch |
| Run time | 10 min |
| Flussrate | 1 ml/min |
| injektionsvolumen | 1 µl |
| Detektor | SPD-40 (Standardzelle) 200 nm |
Daraufhin wurden die Parameter auf die präparativen Dimensionen übertragen (Tabelle 2). Mit dieser Methode wurde eine Messung durchgeführt, um sicherzustellen, dass beide Methoden zu ähnlichen Ergebnissen führen.
| Präperative Methode | |
| System | Nexera Prep/LH-40 |
| Säule | Shim-Pack GIST 5 µm 250 x 20 mm |
| Mobile Phase | Wasser 50%/Acetonitril 50 %/ 0.5 % Phosphorsäure |
| Programm | Isokratisch |
| Laufzeit | 10 min |
| Flussrate | 19 mL/min |
| Injektionsvolumen | 20 µl/1,000 µL |
| Detektor | SPD-M40 (prep cell) 200 nm |
Obwohl die Säulendimensionen deutlich unterschiedlich sind und die Flussrate um 20 ml erhöht wurde, blieb die Trennung nahezu identisch. Auf Basis dieser Verifizierung wurde die Fraktionierung so eingestellt, dass das System zu den entsprechenden Zeiten beginnt, die Verbindungen zu sammeln (Abbildung 6). Zudem wurde die Aufgabemenge deutlich erhöht, um eine maximale Ausbeute der Substanzen zu gewährleisten.
In einem weiteren Schritt können die gewonnenen Fraktionen auf ihre Reinheit überprüft werden. Wie in Abbildung 7 dargestellt, ist in Fraktion 1 keine Salicylsäure mehr nachweisbar, was eine erfolgreiche Isolierung des Wirkstoffs anzeigt.
Die präparative Flüssigchromatographie findet jedoch nicht nur im Pharmabereich Anwendung, sondern spielt auch in der Lebensmittelindustrie, Biotechnologie, Naturstoffchemie und Kosmetikindustrie eine entscheidende Rolle, indem sie zur Isolation und Reinigung von wertvollen Verbindungen beiträgt.
Eine vielseitige Technik für mehr Patientensicherheit
Die Skalierung von analytischen HPLC-Säulen zu präparativen HPLC-Säulen ist ein entscheidender Schritt in der chemischen Synthese und Analyse. Anhand der Synthese von Aspirin® aus Salicylsäure wurde gezeigt, wie präparative HPLC von Shimadzu effektiv Verunreinigungen abtrennt und ein reines Produkt zur Gewährleistung der Patientensicherheit liefert. Diese Technik ist nicht nur für die Aspirin®synthese relevant, sondern auch auf zahlreiche andere chemische Verbindungen anwendbar, was ihre Vielseitigkeit und Bedeutung in verschiedenen Industriebereichen unterstreicht.
